Naukowcy zaprojektowali białko, które wnika w błonę komórki i wygasza stan zapalny

Receptor TLR4 przebija błonę komórkową na wylot i ma fragmenty widoczne z obu jej stron, jednak badacze od lat interesowali się głównie tym, co wystaje na zewnątrz lub do wnętrza cytoplazmy. Naukowcy z Scripps Research postawili na inne podejście: zaprojektowali niewielkie białko, które zagłębia się w tłustą warstwę błony i przyczepia się do TLR4 właśnie w miejscu, gdzie receptor ją przebija. Już w warunkach laboratoryjnych taki zabieg okazał się skuteczny – wyraźnie przytłumił jeden z kluczowych szlaków wywołujących zapalenie. To jeszcze nie jest lek na sepsę ani choroby zapalne jelit, ale dowód, że fragment receptora traktowany dotąd głównie jako konstrukcyjna kotwica może stać się realnym punktem uchwytu dla terapii.

Receptor nie tylko wystaje z komórki

TLR4 to jeden z czujników odpowiedzialnych za wrodzoną odporność organizmu. Wykrywa między innymi lipopolisacharyd (LPS) – składnik zewnętrznej błony wielu bakterii Gram-ujemnych. Po rozpoznaniu takiego sygnału receptor włącza w komórce łańcuch reakcji, który ma pomóc w walce z infekcją.

Centralną rolę w tym procesie odgrywa NF-KB – czynnik, który uruchamia geny potrzebne do odpowiedzi odpornościowej i zapalnej. To mechanizm obronny, jednak gdy pracuje za intensywnie albo za długo, sam staje się źródłem problemów. Nadaktywność TLR4 kojarzono już z sepsą, zapaleniem stawów oraz nieswoistymi chorobami zapalnymi jelit, co od dawna sprawia, że farmakolodzy traktują ten receptor jako atrakcyjny cel. Mimo to do dziś żaden lek celowo blokujący TLR4 nie uzyskał zatwierdzenia FDA.

W nowym projekcie badacze z Scripps Research zrezygnowali z koncentrowania się na dużej, zewnątrzkomórkowej części receptora oraz na jego fragmencie wewnętrznym. Uwagę skupili na krótkim odcinku, który przebiega bezpośrednio przez samą błonę.

W środku jest tłusto, więc jest i trudno

Błona komórkowa składa się głównie z lipidów, a jej wnętrze jest środowiskiem niegościnnym dla większości cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie. Dlatego białka przechodzące przez błonę muszą mieć specjalnie zbudowane odcinki, które dobrze funkcjonują właśnie w takich warunkach. To sprawia, że projektowanie nowych molekuł działających w tym obszarze jest wyjątkowo skomplikowane. Narzędzia obliczeniowe nauczyły się już świetnie przewidywać i projektować struktury białek rozpuszczalnych w wodzie, lecz oddziaływania zachodzące wewnątrz samej błony wciąż są rozpoznane dużo słabiej.

Jeszcze niedawno ogromnym osiągnięciem było samo trafne przewidzenie trójwymiarowej struktury białka na podstawie jego sekwencji. Obecnie naukowcy posuwają się dalej, projektując od podstaw białka z konkretną funkcją – podobne podejście stosowano już wcześniej do tworzenia nowych przeciwciał. W tym przypadku dodatkową trudnością było to, że fragment TLR4 schowany w błonie jest w większości niepolarny i nie dysponuje żadnym wyraźnym, łatwym do uchwycenia motywem strukturalnym.

Komputer zaprojektował kandydatów, laboratorium zrobiło selekcję

Na początku zespół zbadał, czy sama błonowa część TLR4 w ogóle wpływa na funkcjonowanie receptora. Fragment obejmujący domenę transbłonową okazał się zdolny do łączenia się z pełną wersją TLR4, a jego obecność ograniczała aktywację NF-KB. Wskazuje to, że ten odcinek odpowiada za wzajemne ustawienie dwóch cząsteczek TLR4 oraz za przekazywanie sygnału przez błonę.

Dopiero w kolejnym etapie przyszła pora na właściwe projektowanie. Programy komputerowe wygenerowały wiele modeli niewielkich białek, które teoretycznie mogłyby przyłączyć się do helisy transbłonowej TLR4. Same prognozy komputerowe nie były wystarczające, więc badacze zastosowali dodatkowe, własne kryteria oceny tzw. upakowania apolarnego – czyli tego, jak dobrze niepolarne fragmenty dwóch białek powinny do siebie przylegać w tłustym środowisku błony. Z szerokiej listy konstrukcji wyselekcjonowano dziewięć. Osiem z nich wykazało zdolność wiązania TLR4 w żywych komórkach, trzy uznano za szczególnie obiecujące, a najlepszy wynik osiągnęło białko oznaczone jako Design-6.

Design-6 wciska się między receptory

TLR4 uaktywnia się między innymi poprzez łączenie w pary – dwie cząsteczki receptora zbliżają się do siebie, a właściwe ułożenie ich fragmentów przebiegających przez błonę umożliwia przekazanie sygnału z zewnątrz do wnętrza komórki. Design-6 przyłącza się bezpośrednio do transbłonowego odcinka TLR4 i rozregulowuje to ustawienie. Naukowcy wykazali, że mechanizm działania nie polega na zwykłym rozkładaniu receptora czy zmniejszaniu jego liczby – zmienia się za to jego zdolność do przekazywania sygnału.

Po stymulacji komórek lipopolisacharydem aktywność NF-KB spadała proporcjonalnie do wzrostu ilości Design-6. W jednym z eksperymentów maksymalna odpowiedź sygnałowa zmniejszyła się o około 47 proc. względem grupy kontrolnej. Fakt, że efekt zależał od dawki oraz od precyzyjnej sekwencji białka, potwierdza, że to wynik zaplanowanego oddziaływania z TLR4, a nie przypadkowe zablokowanie błony przez losowy, tłusty peptyd.

To bardzo wyrazisty przykład tego, jak daleko zaszło komputerowe projektowanie białek. Te same technologie bywają wykorzystywane nawet do tworzenia nowych wariantów białek toksycznych, ale w tym przypadku posłużyły do znalezienia interakcji, którą klasycznymi metodami praktycznie nie dałoby się zaprojektować.

Na razie to komórki w naczyniu, nie pacjent

Dotychczasowe eksperymenty prowadzono głównie na ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) – popularnych w laboratoriach ze względu na łatwość ich hodowli i modyfikacji. Nie są to jednak komórki układu odpornościowego ani tkanka objęta procesem zapalnym.

Kolejnym etapem ma być sprawdzenie działania Design-6 oraz podobnych cząsteczek w makrofagach, innych komórkach odpornościowych oraz komórkach wątroby. Jeszcze większym wyzwaniem okazuje się dostarczenie takiego białka do organizmu. Cząsteczka powstała specjalnie z myślą o funkcjonowaniu w tłustej błonie, dlatego nie zachowuje się jak klasyczny lek swobodnie rozpuszczający się we krwi.

Konieczne będzie opracowanie sposobu transportu białka do właściwej tkanki i wprowadzenia go do odpowiedniej błony bez zakłócania pracy innych białek. Blokowanie TLR4 nie może być też działaniem przypadkowym, bo receptor ten pełni funkcję jednego z podstawowych systemów ostrzegających organizm przed bakteriami.

Najważniejszy efekt tych badań ma więc obecnie charakter bardziej fundamentalny niż terapeutyczny. Naukowcy udowodnili, że można komputerowo zaprojektować białko trafiające w wyjątkowo trudny cel ukryty w samym centrum błony i za jego pomocą kontrolować sygnał przekazywany przez receptor.

Jeśli metodę tę uda się zastosować wobec innych białek błonowych, liczba potencjalnych celów terapeutycznych znacząco wzrośnie wobec samego TLR4. Znaczna część komunikacji wewnątrzkomórkowej odbywa się właśnie za pomocą receptorów przechodzących przez błonę, a ich zanurzony w lipidach rdzeń był do tej pory jednym z najtrudniej dostępnych obszarów dla projektantów leków. Teraz wiadomo już, że da się w ten obszar wejść.